PCR bao gồm bốn bước sau:
1. Biến tính bằng nhiệt:DNA sợi đôi được tách thành hai sợi đơn bằng một quá trình gọi là biến tính xảy ra ở nhiệt độ cao hơn 90 độ C. Nhiệt phá vỡ liên kết hydro giữa các cặp bazơ, trong khi liên kết mạnh hơn giữa deoxyribose và photphat vẫn còn nguyên.
2. Ủ mồi theo trình tự đích:trước khi trình tự đích (thường là giữa 100-600 cặp bazơ) được sao chép, nó phải được nhắm mục tiêu bằng cách sử dụng các đoạn mồi nhắm vào các đầu của trình tự DNA mục tiêu bằng cách ủ (liên kết) với trình tự bổ sung. Quá trình ủ xảy ra ở nhiệt độ thấp hơn (từ 40 đến 65 độ C), điều này phụ thuộc vào độ dài và trình tự bazơ của mồi.
3. Gia hạn:sau khi ủ, nhiệt độ được tăng lên 72 độ C và enzyme Taq DNA polymerase được sử dụng để sao chép các chuỗi DNA. Trong quá trình tổng hợp (hoặc mở rộng), hai phân tử DNA sợi đôi giống hệt nhau được tổng hợp.
4. Kết thúc chu kỳ PCR đầu tiên:sau đó quá trình được lặp lại thường từ 25 đến 35 lần.